产品货号：
YTC0351
中文名称：
活性Rho结合沉淀与检测试剂盒
英文名称：
Active Rho Pull-down and Detection Kit
产品规格：
50T|250T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种便捷、高效的用于定量检测组织或细胞裂解液中激活状态Rho蛋白(包括RhoA、RhoB和RhoC)的试剂盒。
本试剂盒基于Rhotekin-RBD Agarose (活性Rho结合琼脂糖凝胶)特异性地结合沉淀(Pull-down)激活状态的Rho蛋白，然后通过Western检测Rho蛋白的激活水平(图1)。
图1.活性Rho结合沉淀与检测试剂盒的Pull-down工作原理图。洗脱产物后续可以用于Western检测。
本试剂盒检测NIH 3T3细胞内源性激活状态RhoA蛋白的效果见图2。实验采用GppNHp (鸟苷酰亚胺二磷酸锂)作为GTP替代物，GppNHp与GTPγS类似，都是一种不可水解的GTP类似物。
图2.本试剂盒用于检测NIH 3T3细胞内源性激活状态RhoA蛋白的效果图。NIH 3T3细胞裂解液分别加入终浓度为1mM GppNHp或GDP使RhoA蛋白处于激活状态(Active state)或静息状态(Inactive state)，随后加入20μL Rhotekin-RBD Agarose，置于旋转混合仪上，4℃孵育1小时。后经离心，洗涤，加入1×SDS-PAGE上样缓冲液95℃加热5分钟，经PAGE预制胶(货号：YTC0020)电泳后进行Western检测，使用RhoA单抗孵育。Control为10ng重组人RhoA (泳道1，分子量略大于其它泳道的小鼠样品)，Input为NIH 3T3细胞裂解液(泳道2)。本试剂盒可特异性地结合并Pull-down激活状态的RhoA蛋白(RhoA-GppNHp) (泳道3)，但不结合静息状态的RhoA蛋白(RhoA-GDP) (泳道4)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
Rhotekin是与Rho蛋白(包括RhoA、RhoB和RhoC)相互作用的一种下游效应蛋白(Effector protein)，可控制神经前体细胞的增殖、神经突的生长和突触形成等多种细胞活动。Rhotekin中的“teki”来源于日语“目标”。Rhotekin全长563个氨基酸，理论分子量为61kDa，含有4个结构域：激活状态Rho的结合结构域(RBD)、PH结构域(Pleckstrin homology)和2个脯氨酸富含区结构域(Proline-rich motifs)。Rhotekin的RBD结构域可以特异性的识别并结合激活状态的Rho蛋白，但不结合静息状态的Rho蛋白，因此Rhotekin-RBD重组蛋白可用于检测激活状态的Rho蛋白，在体内或体外也可以作为Rho蛋白的抑制剂使用。
小GTP酶(Small GTPase)，也称Small G-proteins、Ras superfamily，是调节真核细胞信号转导、细胞增殖、细胞骨架重组和细胞内膜转运等过程的分子开关，小GTP酶通过结合和水解GTP，在“激活”和“静息”状态之间循环：在外界信号的刺激下，鸟苷酸交换因子(GEFs)辅助小GTP酶将结合的GDP置换为GTP，小GTP酶结合GTP进入激活状态(Active state)；激活状态的小GTP酶与下游效应蛋白(Effector protein)相互作用，从而刺激细胞发生相应的响应；GTP酶激活蛋白(GAPs)催化小GTP酶结合的GTP水解为GDP，并释放自由磷酸盐(Free phosphate,Pi)，此时小GTP酶结合GDP进入静息状态(Inactive state)，鸟嘌呤核苷酸解离抑制蛋白(GDIs)抑制小GTP酶释放GDP，直到GEFs受到刺激信号再次开启新一轮的循环(图3)。
图3.小GTP酶在“激活”和“静息”状态之间循环的原理图。
小GTP酶在人类中已发现超过150个家族成员，在果蝇、秀丽隐杆线虫、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、黏菌和植物中也都发现了保守的同源物。小GTP酶根据结构和功能被分为5个家族分支：Ras家族、Rho家族、Ran家族、Rab家族和Arf家族。Ras家族本身又被分为6个亚家族：Ras亚家族、Ral亚家族、Rit亚家族、Rap亚家族、Rheb亚家族和Rad亚家族。
Rho家族(Ras homologous GTPases)在真核生物中高度保守，是调节肌动蛋白重组的关键因子，因此在细胞迁移、伤口愈合、细胞粘附、细胞极性、膜转运和细胞分裂等过程中发挥着重要作用。目前有21个成员被发现，被分为8亚家族(见下表)，其中RhoA、Rac1和Cdc42研究的最为广泛。
| Subfamily | Rho | Rac | Cdc42 | RhoH | RhoBTB | RhoUV | Rnd | RhoF |
| Rho family members | RhoA RhoB RhoC | Rac1 Rac2 Rac3 RhoG | Cdc42 RhoQ (TC10) RhoJ (TCL) | RhoH | RhoBTB1 RhoBTB2 RhoBTB3 | RhoU (Wrch) RhoV (Chp) | Rnd1 Rnd2 Rnd3 (RhoE) | RhoD RhoF (Rif) |
| 组分 | 50T | 250T |
| Rhotekin-RBD Agarose | 1mL | 5mL |
| 重组人RhoA (10ng/μL) | 10μL | 50μL |
| 1000×RhoA单抗 | 20μL | 100μL |
| 100×GppNHp | 20μL | 100μL |
| 100×GDP | 20μL | 100μL |
| Cell Lysis Buffer | 50mL | 250mL |
| Wash Buffer | 50mL | 250mL |
| 100mM EDTA (pH8.0) | 200μL | 1mL |
| 500mM MgCl2 | 600μL | 3mL |
| 100×蛋白酶抑制剂混合物 | 100μL | 500μL |
保存：-80℃，有效期1年。
- 除Rhotekin-RBD Agarose外，-20℃保存，一年有效。Rhotekin-RBD Agarose，-20℃保存3个月内有效，4℃保存一个月内有效。Cell Lysis Buffer、Wash Buffer、100mM EDTA (pH8.0)、500mM MgCl2，4℃保存3个月内有效。
- Rhotekin-RBD Agarose到货后推荐-80℃冻存，冻融两次有效，避免反复冻融，第一次使用可适当分装。其余试剂可以-20℃冻存。
- Rhotekin-RBD Agarose储存溶液:50mM HEPES (pH7.4),150mM NaCl,5mM MgCl2,0.5% Triton X-100,1mM DTT,10% glycerol。
按照单次使用20μL Rhotekin-RBD Agarose计算，两个包装的本制品分别用于50次和250次实验。
- 本试剂盒的使用次数按照单次使用20μL或50μL Rhotekin-RBD Agarose来设置。当使用不同量Rhotekin-RBD Agarose时，其它试剂用量也需要相应按比例进行调整。
- 试剂盒的准备：
- 含抑制剂裂解液的配制：按照每50～100万细胞使用100～200μL含抑制剂裂解液，配制适量的含抑制剂裂解液。将Cell Lysis Buffer与500mM MgCl2、100×蛋白酶抑制剂混合物按照98∶1∶1的比例混合，例如在980μL的Lysis Buffer中加入10μL 500mM的MgCl2、10μL 100×蛋白酶抑制剂混合物，即得1mL含抑制剂裂解液。配制好的含抑制剂裂解液置冰浴或4℃。
- 含MgCl2和抑制剂的裂解液宜现用现配，不宜冻融(可能会有沉淀产生)，不宜配制后冻存并留作后续使用。如果有特殊需求，可以尝试百奥莱博的其它多种蛋白酶、磷酸酶和去乙酰化酶抑制剂混合物。
- 1×TBS的配制：由于Mg2+参与Rho蛋白与GTP和GDP的结合，使用含有磷酸根的缓冲液(如PBS)会生成难溶于水的磷酸镁影响后续Pull-down实验。推荐使用10×TBS，免除磷酸根的干扰。用超纯水将TBS稀释至1X备用，例如取1mL 10×TBS加入9mL超纯水，混匀后即为1×TBS。
- Rhotekin-RBD Agarose的准备：由于Rhotekin-RBD Agarose储存在保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
① 轻轻重悬Rhotekin-RBD Agarose，尽量形成均匀的凝胶悬浊液，按照通常每200μL细胞或组织裂解液中加入20μL混合均匀的凝胶悬浊液，取适量Rhotekin-RBD Agarose至一洁净离心管中，按照每20μL凝胶悬浊液加入约100～180μL Cell Lysis Buffer的比例，加入Cell Lysis Buffer进行洗涤。- 建议使用大孔径吸头(如用剪刀剪去部分吸头)吸取凝胶悬浊液，减少机械剪切力对凝胶的损伤。
③ 按照初始的凝胶悬浊液的体积，用Cell Lysis Buffer重悬Rhotekin-RBD Agarose。 - 1×SDS-PAGE Sample Loading Buffer的配制：推荐直接使用1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，或将适量SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(YT620/YT051/YT052)用超纯水稀释至1×后再使用。
- 含抑制剂裂解液的配制：按照每50～100万细胞使用100～200μL含抑制剂裂解液，配制适量的含抑制剂裂解液。将Cell Lysis Buffer与500mM MgCl2、100×蛋白酶抑制剂混合物按照98∶1∶1的比例混合，例如在980μL的Lysis Buffer中加入10μL 500mM的MgCl2、10μL 100×蛋白酶抑制剂混合物，即得1mL含抑制剂裂解液。配制好的含抑制剂裂解液置冰浴或4℃。
- 细胞或组织样品的裂解和准备：
- 样品裂解后宜立即进行Pull-down，如果不能立即进行后续的实验，样品应尽快分装，用液氮速冻后-80℃冻存，请勿反复冻融。若有沉淀产生，则不宜冻存后进行检测。
- 裂解和Pull-down实验过程中需时刻保证样品在冰浴或4℃操作，以尽量减少蛋白降解的可能性。
- 样品准备好后，留取一定量作为Input，用于后续的Western检测。
- 裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。
- 如有待测的激活剂或抑制剂可提前对样品进行处理。
- 悬浮细胞的样品裂解和准备：250×g室温离心5分钟收集细胞，用4℃预冷的1×TBS洗涤一次，然后吸净残留的液体。轻轻vortex或者弹击管底把细胞尽量分散开。按照每50～100万细胞的比例加入100～200μL 4℃预冷的含抑制剂裂解液。轻弹管底或适当吹打，使裂解液与细胞充分接触，以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，建议分装成50～100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液易与细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。充分裂解后，14000×g在4℃离心5分钟，取上清，即可进行后续的Pull-down实验。
- 贴壁细胞样品的裂解和准备：吸除培养液。用4℃预冷的1×TBS洗涤一次，然后吸净残留的液体。按照每50～100万细胞(相当于6孔板的一个孔)加入100～200μL 4℃预冷的含抑制剂裂解液，适当吹打，使裂解液与细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1～2秒后，细胞就会被裂解。充分裂解后，14000×g在4℃离心5分钟，取上清，即可进行后续的Pull-down实验。
- 1×TBS的残留可能会影响后续实验，因此建议在吸净1×TBS后，将细胞培养皿在冰上以一定角度倾斜静置1分钟后，以彻底吸净残留的液体。
- 组织样品的裂解和准备：
① 把组织剪切成细小的碎片。如果组织样品本身非常细小，也可以不再进行剪切。
② 按照每10～20mg组织加入100～200μL 4℃预冷的含抑制剂裂解液。- 如果裂解不充分可以使用更多4℃预冷的含抑制剂裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
④ 充分裂解后，14000×g在4℃离心5分钟，取上清，即可进行后续的Pull-down实验。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200μL含抑制剂裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15～25mg/mL，不同状态的不同组织有所不同。
- 对照组的设置：
本实验一般设置Control组、Input组、GppNHp处理组(阳性对照组)、GDP处理组(阴性对照组)，如有待测的激活剂或抑制剂可设为样品处理组。- 重组人RhoA组(Control组)
本试剂盒提供重组人RhoA (10ng/μl)作为Western检测的阳性对照，也可以作为衡量内源性Rho蛋白表达量的参照。通常约10ng重组人RhoA足够在Western检测中能得到较好信号。- Rho蛋白(包括RhoA、RhoB和RhoC)理论分子量为20～25kDa，重组人RhoA因带有Flag标签比内源性RhoA蛋白分子量偏大(约30kDa)。
- 细胞或组织裂解液GppNHp/GDP处理组(阳性/阴性对照组)
为准确检测细胞或组织裂解液中激活状态的Rho蛋白，保证Pull-down实验的正确操作，建议每次实验额外准备2组样品，分别加入GppNHp或GDP使裂解液中全部Rho蛋白分别处于激活状态(阳性对照)或静息状态(阴性对照)。
① 向200μL的细胞或组织裂解液样品中加入20μL 100mM EDTA(pH8.0)，螯合细胞或组织裂解液样品中的Mg2+，使裂解液中的Rho蛋白释放其本身结合的GTP或GDP，轻轻吹打混匀。
② 根据阳性对照和阴性对照的设置，加入2μL 100×GppNHp或100×GDP，轻轻吹打混匀，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育15～30分钟。
③ 加入2μL 500mM的MgCl2将GppNHp或GDP锁定在Rho蛋白上。
④ 后续操作同实验组，即步骤4。
- 重组人RhoA组(Control组)
- Pull-down激活状态Rho蛋白：
- 向200μL的细胞或组织裂解液样品中加入20μL经Cell Lysis Buffer洗涤过的Rhotekin-RBD Agarose，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，4℃孵育1～2小时。
- Rhotekin-RBD Agarose的投入量可适当进行调整，例如投入量为20～50μL。相同的样品，不同投入量的Rhotekin-RBD Agarose可能导致不同的结果。如果Rhotekin-RBD Agarose投入量过低，可能无法有效并充分地Pull-down激活状态的Rho蛋白；如果Rhotekin-RBD Agarose投入量过高，可能导致Rhotekin-RBD Agarose非特异性结合静息状态的Rho蛋白，导致假阳性的出现；通常20～50μL Rhotekin-RBD Agarose能得到较好的效果，但是仍需要根据实际情况调整Rhotekin-RBD Agarose的用量。但为了方便起见，更建议固定Rhotekin-RBD Agarose的用量不变，而适当调整样品裂解液的用量或浓度。裂解液中激活状态Rho蛋白过多时，可能会使Rhotekin-RBD Agarose饱和，从而超出检测范围。如果样品的信号低于添加了GppNHp的阳性对照的信号，说明Rhotekin-RBD Agarose并未饱和，检测结果仍然在可信范围内。
- 6000×g在4℃离心30秒，小心去除上清，注意不要吸到凝胶。
- 加入250μL 4℃预冷的Wash Buffer，上下颠倒重悬凝胶，6000×g在4℃离心30秒，小心去除上清，注意不要吸到凝胶。重复本步骤三次。
- 加入50μL 1×SDS-PAGE Sample Loading Buffer，95℃加热5分钟。样品可直接上样SDS-PAGE胶进行电泳，如果不能立即进行后续的实验，可以-20℃冻存。
- 向200μL的细胞或组织裂解液样品中加入20μL经Cell Lysis Buffer洗涤过的Rhotekin-RBD Agarose，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，4℃孵育1～2小时。
- Western检测：
- 蛋白样品平衡到室温后，取10～30μL Pull-down后的各组样品(Control组、Input组、阳性对照组、阴性对照组、样品处理组)上样至PAGE预制胶(Tris-Gly,4～20%,10孔)进行电泳，随后进行转膜。
- 推荐选用PVDF膜(YTB1206/YTB1205/YTB1201/YTB1202)，其中优先推荐使用货号YTB1204。PVDF膜在使用前须经浸润和活化，推荐使用安全无毒的PVDF膜活化浸润液。也可以使用硝酸纤维素膜(YTB1203/YTB1207)，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先加入Western洗涤液(YT068/YT069)的Western洗膜盒中，漂洗1～2分钟，以洗去膜上的转膜液。
- 转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
- 用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，优先推荐加入适量的FastBlock Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭10分钟；也可以加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。
- 吸尽封闭液，立即加入按照1:1000比例用FastBlock Western一抗稀释液或Western一抗稀释液稀释的1000×RhoA单抗，4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜。
- 回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5～10分钟，重复洗涤3次。
- 如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
- 按照适当比例用FastBlock Western二抗稀释液或Western二抗稀释液稀释HRP标记的二抗，推荐使用HRP标记山羊抗兔IgG。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
- 回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5～10分钟，重复洗涤3次。
- 如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
- 使用特超灵敏ECL化学发光试剂盒或极超灵敏ECL化学发光试剂盒等ECL类试剂来检测蛋白。
- Rho蛋白(包括RhoA、RhoB和RhoC)理论分子量为20～25kDa。
- 蛋白样品平衡到室温后，取10～30μL Pull-down后的各组样品(Control组、Input组、阳性对照组、阴性对照组、样品处理组)上样至PAGE预制胶(Tris-Gly,4～20%,10孔)进行电泳，随后进行转膜。
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